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產品中心
產品詳情
  • 產品名稱: 一步法RT-PCR擴增試劑盒(去除基因組)

  • 產品型號: 100次×20ul
  • 產品廠商:通蔚生物
  • 產品價格:2737
  • 產品庫存:127
  • 產品文檔:
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簡單介紹:
一步法RT-PCR擴增試劑盒(去除基因組)本試劑盒包括極其靈敏的去除基因組DNA 的酶,可在瞬間徹底清-除殘留的基因組還有全新高效逆轉錄酶、快速熱啟動 DNA 聚合酶,同時包含適用于逆轉錄和 PCR 擴增的反應緩沖液和實驗中所必需的其它組分。SuperRT 逆轉錄酶RNaseH活性缺失,減少了逆轉錄反應中 RNA 的降解。該逆轉酶逆轉錄效率高,可對少量RNA模板進行良好的逆轉錄反應。
詳情介紹:
產品特點
1. 試劑盒是專為一步法 RT-PCR 實驗研制,去除基因組DNA、逆轉錄和PCR在一反應體系中進行,反應過程中無需添加試劑,無需打開管蓋,在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗效率。
2. 本試劑盒包括極其靈敏的去除基因組DNA 的酶,可在瞬間徹底清-除殘留的基因組還有全新高效逆轉錄酶、快速熱啟動 DNA 聚合酶,同時包含適用于逆轉錄和 PCR 擴增的反應緩沖液和實驗中所必需的其它組分。SuperRT 逆轉錄酶RNaseH活性缺失,減少了逆轉錄反應中 RNA 的降解。該逆轉酶逆轉錄效率高,可對少量RNA模板進行良好的逆轉錄反應。
3. PCR反應使用的快速熱啟動DNA聚合酶具有擴增效率高、特異性強、延伸速度快的優良性能。獨特的緩沖體系使逆轉錄酶和聚合酶同時發揮大功效。使用本試劑盒擴增得到的目的產物 3′端附有一個″A″堿基,可直接用于T/A克隆。

保存條件
長期保存,請置于-20℃,有效期 12 個月。使用后請及時放入-20℃保存以保證酶
的活性。

使用方法
1.將 RNA 模板、引物、2×OneStep RT-PCR Mix(with gDNase)和RNase-Free Water 溶解并置于冰上備用。
2. 按下表加入試劑,至終體積 20 μl:

試劑

20μl反應體系

終濃度

2×OneStep RT-PCR Mix

10μl

Forward Primer,10 μM

0.5μl

0.25μM

Reverse Primer,10 μM

0.5μl

0.25μM

RNA Template

Xμl

1pg -1μg

RNase-Free Water

up to 20μl


注 意:
引物濃度請以終濃度 0.1-1.0μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發生非特異性反應時,可降低引物濃度,由此優化反應體系。3. 渦旋震蕩混勻,短暫離心,將溶液收集到管底。
4. 置反應程序,將 PCR 管置于熱循環儀中,進行 RT-PCR 反應。

反應條件:

過程

溫度

時間

去除基因組 DNA

37℃

5min

反轉錄

50℃

5-30min

PCR預變性

95℃

2min

3040cycles

變性

95℃

30sec

退火

55-65℃

30sec

延伸

72℃

1kb/30sec

終延伸

72℃

5min

注 意:
A. 一般 PCR 實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度 Tm 低 5℃,退火時間一般為20-30 秒,無法得到理想的擴增效率時,適當降低退火溫度;發生非特異性反應時,提高退火溫度,由此優化反應條件。
B. 延伸時間根據擴增的片段大小設定,本產品中包含的 DNA Polymerase擴增效率為1 kb/30s。
C. 可根據擴增產物的下游應用設定循環數。循環次數太少,擴增量不足;循環次數多,錯配機率會增加,非特異性背景嚴重。所以,在保證產物得率的前提下,應盡量減少循環次數)
5. 反應結束后取 5 μl 反應產物,加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結果。
注意事項
1. 在操作過程中應避免 RNase 污染,防止 RNA 降解或實驗中的交叉污染,建議在專門的區域進行 RNA 操作,使用專門的儀器和耗材,操作人員帶口罩和一次性手套并經常更換手套。
2. 實驗盡量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,應使用 0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在 37℃處理 12 小時,并在 120℃下高壓滅-菌 30 分鐘后使用,或者將玻璃器皿在180℃下干熱滅-菌 60 分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用0.1%的DEPC處理后進行高壓滅-菌。
3.本試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻,盡量避免起泡,并經短暫離心后使用。使用后應盡快放回-20℃,避免反復凍融。
4.本試劑盒必須使用特異性引物,引物的選擇可根據具體實驗來選擇,引物設計的好壞直接影響到 RT-PCR 反應的結果,設計引物時需考慮 GC 含量,引物長度,引物位置,PCR產物的二級結構等因素,建議采用專業的引物設計軟件來設計。
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