產(chǎn)品特點(diǎn)
本試劑盒是專為一步法 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)研制，逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免污染的同時(shí)提高了檢測靈敏度和實(shí)驗(yàn)效率。本試劑盒包括全新高效逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動(dòng) DNA 聚合酶，同時(shí)包含適用于逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液和實(shí)驗(yàn)中所必需的其它組分。
SuperRT 逆轉(zhuǎn)錄酶RNaseH活性缺失，減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中 RNA 的降解。該逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄效率高，可對少量RNA模板進(jìn)行良好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR 反應(yīng)使用的快速熱啟動(dòng) DNA 聚合酶具有擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、延伸速度快的優(yōu)良性能。獨(dú)特的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時(shí)發(fā)揮大功效。使用本試劑盒擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物 3′端附有一個(gè)″A″堿基，可直接用于T/A克隆。
保存條件
長期保存，請置于-20℃，有效期 12 個(gè)月。使用后請及時(shí)放入-20℃保存以保證酶的活性。
使用方法
1. 將 RNA 模板、引物、2×OneStep RT-PCR Mix 和 RNase-Free Water 溶解 并置于冰上備用。
2. 按下表加入試劑，至終體積 20 μl：
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試劑
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20μl反應(yīng)體系
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終濃度
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2×OneStep RT-PCR Mix
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10μl
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1×
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Forward Primer，10 μM
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0.5μl
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0.25μM
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Reverse Primer，10 μM
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0.5μl
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0.25μM
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RNA Template
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Xμl
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1pg -1μg
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RNase-Free Water
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up to 20μl
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／
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注 意：
引物濃度請以終濃度 0.1-1.0μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
3. 渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。
4. 設(shè)置反應(yīng)程序，將 PCR 管置于熱循環(huán)儀中，進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)。
反應(yīng)條件：
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過程
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溫度
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時(shí)間
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反轉(zhuǎn)錄
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50℃
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5-30min
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PCR預(yù)變性
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95℃
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2min
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30－40cycles
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變性
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95℃
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30sec
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退火
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55-65℃
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30sec
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延伸
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72℃
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1kb/30sec
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終延伸
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72℃
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5min
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注 意：
A. 一般 PCR 實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度 Tm 低 5℃，退火時(shí)間一般為20-30 秒，無法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
B. 延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增的片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品中包含的 DNA Polymerase擴(kuò)增效率為1 kb/30s。
C. 可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；循環(huán)次數(shù)多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù))
5. 反應(yīng)結(jié)束后取 5 μl 反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測結(jié)果。
注意事項(xiàng)
1. 在操作過程中應(yīng)避免 RNase 污染，防止 RNA 降解或?qū)嶒?yàn)中的交叉污染，建議在專門的區(qū)域進(jìn)行 RNA 操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)常更換手套。
2. 實(shí)驗(yàn)盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應(yīng)使用 0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃處理 12 小時(shí)，并在 120℃下高壓滅-菌 30 分鐘后使用，或者將玻璃器皿在180℃下干熱滅-菌 60 分鐘后使用。實(shí)驗(yàn)中用到的無菌水應(yīng)使用0.1%的DEPC處理后進(jìn)行高壓滅-菌。
3.本試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用。使用后應(yīng)盡快放回-20℃，避免反復(fù)凍融。
4.本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來選擇，引物設(shè)計(jì)的好壞直接影響到 RT-PCR 反應(yīng)的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物時(shí)需考慮 GC 含量，引物長度，引物位置，PCR產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)等因素，建議采用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件來設(shè)計(jì)。
